脊髓损伤大鼠远端神经元及骨骼肌的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.013

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (33): 5323-5328.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.013

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脊髓损伤大鼠远端神经元及骨骼肌的变化

王元元¹，洪毅^2，3，王雪菲³，蔡青⁴，唐和虎^2，3，李想^2，3，梁广旭³，张军卫^2，3

¹北京市第二医院，北京市 100031；²中国康复研究中心脊柱脊髓外科，北京市 100068；³首都医科大学康复医学院，北京市 100069；⁴首都医科大学实验与测试中心，北京市 100069

出版日期:2014-08-13 发布日期:2014-08-13
通讯作者: 张军卫，副教授，硕士生导师，中国康复研究中心脊柱脊髓外科，北京市 100068；首都医科大学康复医学院，北京市 100069
作者简介:王元元，女，1984年生，安徽省灵璧县人，汉族，2012年首都医科大学毕业，硕士，医师，主要从事脊柱外科及脊髓损伤康复研究。

Change of motor neurons and skeletal muscles distal to the lesion after spinal cord injury in rats

Wang Yuan-yuan¹, Hong Yi^{2, 3}, Wang Xue-fei³, Cai Qing⁴, Tang He-hu ^{2, 3}, Li Xiang^{2, 3}, Liang Guang-xu³, Zhang Jun-wei ^{2, 3}

¹ Department of Rehabilitation, the Second Hospital of Beijing, Beijing 100031, China; ² Department of Spine Surgery, China Rehabilitation Research Center, Beijing 100068, China; ³ School of Rehabilitation Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China; ⁴Core Facilities Center, Capital Medical University, Beijing 100069, China

Online:2014-08-13 Published:2014-08-13
Contact: Zhang Jun-wei, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Spine Surgery, China Rehabilitation Research Center, Beijing 100068, China; School of Rehabilitation Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China
About author:Wang Yuan-yuan, Master, Physician, Department of Rehabilitation, the Second Hospital of Beijing, Beijing 100031, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前针对脊髓损伤病灶的研究较多，而对脊髓损伤后远端神经、肌肉及运动终板三者形态结构实时变化观察和研究的文献很少。
目的：观察大鼠脊髓损伤后远端肢体神经、运动终板和骨骼肌随时间推移形态学变化的自然病程。
方法：将50只雌性SD大鼠随机分为对照组5只(不做处理)、假手术组10只和脊髓损伤组35只，假手术组行单纯椎板切除术，脊髓损伤组在椎板切除基础上，用横断法制成T₁₀完全脊髓损伤模型，然后在第1，2，4，12，24周分别观察3组大鼠坐骨神经-运动终板-内侧腓肠肌的形态变化。
结果与结论： ①脊髓损伤组大鼠4周时部分有髓神经纤维髓鞘出现板层分离；24周时崩解髓鞘板层已模糊、碎裂髓鞘增多，薄髓与无髓神经纤维较12周时增多。②脊髓损伤组大鼠运动终板在脊髓损伤12周时明显退变突触结构与较完整突触结构并存；24周时已找不到运动终板。③脊髓损伤组大鼠内侧腓肠肌在脊髓损伤24周时，肌细胞融合，细胞核密集，融合细胞间可见大小不一空隙，结缔组织增生更加明显。结果表明大鼠在完全性横断性脊髓损伤后自然病程中，损伤平面以下周围神经、运动终板、骨骼肌的形态结构均呈规律性改变，损伤后12周时已有显著变化，24周时呈结构毁坏性改变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 脊髓损伤, 坐骨神经, 运动终板, 腓肠肌, 髓鞘板层, 突触, 透射电镜

Abstract:

BACKGROUND: The majority of studies focus on the lesions of spinal cord injury, while little evidence is available on the change of morphology and structure of distal nerve, muscle and motor endplates following spinal cord injury.
OBJECTIVE: To investigate the time window change of the morphology of motor neurons and skeletal muscles caudal to the lesion after spinal cord injury in rats.
METHODS: Fifty healthy adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: control group (n=5; without treatment), sham operation group (n=10), and spinal cord injury group (n=35). The sham operated rats only received laminectomy. In the spinal cord injury group, rats were subject to complete T₁₀spinal cord injury by total laminectomy and cord transverse resection. Then the morphological change including sciatic nerve, motor endplate and median gastrocnemius was observed for each group at 1, 2, 4, 12, 24 weeks after injury.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The myelin sheath layers of sciatic nerve were separated partially at 4 weeks in rats with spinal cord injury, the myelin sheaths were fragmented with the regeneration of thin-myelinated and unmyelinated axons at 12 weeks. There was a decrease in myelinated axons and an increase in thin-myelinated
and unmyelinated axons at 24 weeks. (2) The synaptic gutters of motor endplate, the presynaptic and postsynaptic membrane and synaptic space were distinct at 4 weeks in rats with spinal cord injury, the degenerated motor endplates coexsisted with the intact ones at 12 weeks. The motor endplate disappeared at 24 weeks. (3) There was a slight decrease in muscle cross-sectional area at 2 weeks in rats with spinal cord injury, but no structural change was found, the membrane of myocytes was partially weakened at 4 weeks, the border of myocytes was obscure with hyperplasia of connective tissue at 12 weeks, and myocytes gathered and in fusion at 24 weeks. As natural history of completely transected spinal cord injury in rats, there were significant changes in morphology of peripheral nerve, motor endplate and skeletal muscles caudal to the lesion at 12 weeks, and the changes were destructive at 24 weeks.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: spinal cord injury, neurons, skeletal muscles, morphology

中图分类号:

R318

王元元，洪毅，王雪菲，蔡青，唐和虎，李想，梁广旭，张军卫. 脊髓损伤大鼠远端神经元及骨骼肌的变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(33): 5323-5328.

Wang Yuan-yuan, Hong Yi, Wang Xue-fei, Cai Qing, Tang He-hu, Li Xiang, Liang Guang-xu, Zhang Jun-wei . Change of motor neurons and skeletal muscles distal to the lesion after spinal cord injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(33): 5323-5328.

图/表（结果） 3

2.1 参与实验大鼠数量分析实验选用SD大鼠50只，分为3组，实验过程无脱落，全部进入结果分析，

2.2 坐骨神经-运动终板-内侧腓肠肌的形态观察结果

2.2.1 坐骨神经透射电镜下观察结果整个观察过程中，对照组一直有髓神经纤维与无髓神经纤维并存，髓鞘外形正常。假手术组有髓神经纤维髓鞘外形正常。脊髓损伤组呈现规律性变化：术后2周有髓神经纤维髓鞘正常，与无髓神经纤维并存；术后4周部分有髓神经纤维髓鞘崩解、板层分离，并存正常有髓神经纤维与无髓神经纤维；术后12周时，有髓神经纤维髓鞘崩解增多、碎裂，崩解髓鞘板层清晰，新生神经纤维髓鞘管细壁薄，无髓神经纤维增多，术后12周时，有髓神经纤维髓鞘崩解，崩解髓鞘板层清晰，术后24周有髓神经纤维崩解髓鞘板层已模糊、碎裂髓鞘增多，薄髓与无髓神经纤维较12周时增多，术后24周有髓神经纤维崩解髓鞘板层已模糊(图1)。

2.2.2 腓肠肌内侧光镜下观察结果对照组肌细胞肌束膜及肌内膜边界清晰，肌细胞核位于肌膜下方。假手术组术后2周时，肌细胞肌束膜及肌内膜边界清晰。脊髓损伤组术后2周时，肌细胞截面积略缩小，余较对照组无明显变化；术后4周时，肌细胞截面积较脊髓损伤2周时缩小，局部肌细胞破坏；术后12周时，局部肌细胞边界清晰，多数肌细胞边界模糊，肌细胞核相对聚集，结缔组织增生明显；术后24周时，肌细胞融合，细胞核密集，融合细胞间可见大小不一空隙，结缔组织增生更加明显(图2)。

2.2.3 运动终板透射电镜下观察结果脊髓损伤组术后4周时，突触皱褶结构清晰，突触内可见较均匀细颗粒状物质。高倍观察见突触皱褶清晰，突触前膜、突触间隙、突触后膜清晰可辨，各结构内可见细小颗粒。脊髓损伤组术后12周时，突触皱褶及突触前、后膜可辨，突触内颗粒可见细小颗粒，肌纤维明、暗带较清晰，Z线不连续；高倍观察见突触皱褶清晰，突触突触前膜、突触间隙、突触后膜层次分明，各层结构内可见细小颗粒，突触间隙内可见多个类圆形突触小泡，肌板清晰；同时可见脊髓损伤组术后伤12周时，突触皱褶及突触前、后膜不可辨，隐约可见突触内颗粒，突触前结构凌乱；肌纤维明、暗带较清晰，Z线不连续。高倍观察示突触皱褶未见，及突触前、后膜不可辨，可见类圆形突触小泡及细小颗粒，肌板结构尚清晰(图3)。

参考文献

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引言

脊髓损伤给患者带来巨大痛苦和负担。其治疗的目的是恢复损伤平面以下运动及排泄功能。这需要脊髓传导性、脑和周围神经肌肉都保持或恢复良好功能，三者缺一可。事实上，如果出现远端神经或肌肉不可逆变化，脊髓传导恢复也就没有实际意义了。 McBride^[1]使用荧光金(Fluoro-Gold)逆行标记发现，T₉完全性脊髓损伤大鼠在损伤后10，20，52周右侧坐骨神经的运动神经元数目及分布均较对照组无差异，在损伤后20周所标记神经元的平均截面积均较对照组无明显差异，认为在脊髓损伤后并没有发生跨神经元变性。国内学者张少成等^[2]在动物实验中，切断犬T₁₂脊髓制造完全性截瘫动物模型，于伤后3，6周切取下肢全部神经干，病理检查发现，神经纤维、髓鞘等均无明显变性。张庆民^[3]在大鼠T₁₀完全性脊髓横断损伤实验中，光镜及电镜观察腓总神经的形态学变化，发现脊髓损伤后腓总神经髓鞘和轴索出现明显退变,且退变随时间推移逐渐加重，同时出现轴突发芽现象，认为大鼠完全横断性脊髓损伤可以导致损伤水平以下周围神经发生跨神经元变性。

目前针对脑、脊髓的研究较多，而关于远端神经肌肉的研究甚少。同时在对脊髓损伤后远端神经肌肉形态变化的研究中，针对神经、肌肉、运动终板中某一方面进行研究的居多，而对三者的形态结构同时观察的文献未检索到。

本文旨在研究完全性脊髓损伤后损伤平面以下神经、肌肉、运动终板在自然病程中的形态学变化，为脊髓损伤的临床治疗和相关研究提供类似时间窗的参考依据。

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材料方法

设计：实验研究。

时间及地点：2012年12月30日于首都医科大学实验与测试中心完成。

材料：成年(7周龄)雌性SPF等级SD大鼠50只，体质量为200-220 g，实验动物由首都医科大学提供。

实验方法：

动物分组：将50只大鼠数字化随机法分为3组：对照组5只、假手术组10只和脊髓损伤组35只。对照组为正常大鼠，假手术组实施T₁₀椎板切除术，脊髓损伤组实施T₁₀椎板切除及相应脊髓全横断。然后在第1，2，4，12，24周分别观察3组大鼠坐骨神经-运动终板-内侧腓肠肌的形态变化。

动物模型的制备：大鼠术前禁食12 h，称质量，采用体积分数10%水合氯醛3.0-4.0 mL/kg腹腔注射麻醉。俯卧位固定于手术台上，备皮消毒后，以T₁₀棘突为中心行背部正中纵行切口，长约3 cm，紧贴棘突骨面纵形分离椎旁肌及软组织，显露出T₉-T₁₁的椎板和棘突，咬除T₉-T₁₁棘突并移除T₁₀的椎板，充分暴露T₁₀水平的脊髓。用眼科剪刀迅速横断T₁₀水平的脊髓，并于脊髓断端头侧切除2 mm脊髓组织^[4-5]，轻轻移除后于脊髓断端之间植入明胶海绵。术毕将椎旁肌、筋膜及皮肤逐层对合缝合。实验期间每日人工排尿两三次，直到动物自身排尿反射恢复。假手术组仅行棘突和椎板切除，不损伤脊髓。

取材及模型制备：每组在预订取材时间点以体积分数10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3.0-4.0 mL/kg)，自左心室插管后剪开右心耳，快速灌注生理盐水冲洗，待流出的液体清亮后，用40 g/L多聚甲醛经心脏缓慢灌注，灌注结束后于右侧后肢取出坐骨神经干1 cm、腓肠肌肌腹中部神经入肌点处取出约0.8 cm的整段肌肉(运动终板)及小腿内侧腓肠肌肌腹1 cm，在40 g/L多聚甲醛中固定12 h，进行后固定等处理后，分别进行石蜡包埋。将内侧腓肠肌标本进行连续横向切片，切片厚度是10 μm，行苏木精-伊红染色并光镜观察；将坐骨神经及运动终板标本行半薄切片(片厚0.5 μm)后进行光镜定位，超薄切片(片厚50 nm)后行电子染色(铅-铀染色)并进行透射电镜观察。

主要观察指标： ①坐骨神经的电镜观察。②内侧腓肠肌光镜观察。③内侧腓肠肌运动终板电镜观察。

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讨论

3 讨论 Discussion 3.1 脊髓损伤后周围神经形态变化实验发现：大鼠胸脊髓横断性损伤4周时坐骨神经已出现有髓神经纤维髓鞘退变，并随时间进行性加重，12周时髓鞘崩解、碎裂明显，伴有新生薄髓及大量无髓神经纤维，24周时髓鞘碎裂更加明显，且髓鞘板层结构模糊，而假手术组大鼠坐骨神经形态较对照组无变化，表明了脊髓损伤后其远端神经元发出的轴突构成的周围神经发生了退变，并随时间进行性加重，作者认为脊髓损伤后存在跨神经元变性。然而，关于脊髓损伤后损伤平面以下运动神经元及其轴突构成的周围神经是否发生跨神经元变性一直存在争议。

关于跨神经元变性的报道差异，考虑与以下因素有关：①实验动物不同。不同实验动物的寿命不同，那么在造成脊髓损伤后其发生跨神经元变性的时间窗可能有差异。②观察时间不同。对于同一实验动物而言，脊髓损伤后各研究选择的观察时间有所差异，有早期研究，亦有长程研究，导致观察结果不同。③动物模型不同。脊髓损伤的动物模型制作有多种方式，包括：挫伤模型、压迫模型、缺血损伤模型、横断模型，对同一实验动物，不同的脊髓损伤模型对损伤远端结构形态及运动功能影响亦不同。④研究方法不同。关于跨神经元变性的研究方法，有间接的方式，包括下运动神经元逆行标记法、体视学测量技术等，也有直接的方法，包括神经活检病理技术、灌注固定光镜电镜观察等。通过神经元数目或体积的测量，相较于更直接的形态学观察尤其超微结构的观察，后者更有说服力，并且这些方法上的不同，一定程度上也导致了研究结果的差异。

3.2 脊髓损伤后运动终板形态变化实验通过透射电镜观察到脊髓横断性损伤4周时内侧腓肠肌运动终板结构完整，突触皱褶清晰，12周时退变运动终板与完整运动终板并存，但在24周时已找不到运动终板，表明在完全性脊髓损伤的自然病程中，随着观察时间的延长，运动终板结构逐渐出现了不可逆退变。

国内外学者通过不同技术对脊髓损伤后运动终板进行研究，均发现有运动终板结构退变。段平国^[6]通过氯化金染色发现，脊髓半横断损伤大鼠在脊髓损伤 1，2周时运动终板在着色、数量上与正常组无明显差别；脊髓损伤4周时肌纤维运动终板开始出现退变，终板染色变浅，轴索终末分枝减少，终板核减少，肌浆淡染，部分终板边缘皱缩，中央出现空泡样淡染区；脊髓损伤8周时运动终板明显退变，出现大的染色空白区，终板减少甚至消失，显示模糊的轮廓。Burns等^[7]通过免疫组织化学技术，证明了横断性脊髓损伤大鼠其后肢神经肌肉接头发生了解剖学不稳，包括突触前轴突终末的回缩、突触后Ach受体的丢失、并行的突触前后结构的减少以及轴突终末的芽生，并且神经肌肉突触出现的选择性分解提示NMJs存在着多种亚群，其突触前、后结构的易损性有明显差异。其在研究中发现在脊髓横断后2周内侧腓肠肌的突触稳定，没有出现分解或重组较少。Rigoard等^[8]在大鼠脊髓半切损伤实验中，通过免疫组织化学方法用激光共聚焦显微镜观察NMJ分子成分的定位与表达；用光镜和电镜观察神经和肌肉的退变。结果发现无病理改变的NMJs与完全失神经支配的NMJs、神经再支配的NMJs共存。

3.3 脊髓损伤后骨骼肌形态变化本实验发现，脊髓损伤后4周时内侧腓肠肌肌细胞截面积缩小，随着观察时间延长，12周时肌细胞萎缩明显，并伴有大量结缔组织增生，24周时肌细胞已大片融合，无法明确分辨肌细胞结构，且结缔组织增生更明显，而假手术组大鼠内侧腓肠肌形态较对照组无变化，表明肌细胞在完全性脊髓损伤后无干预措施情况下经历着进行性退变，早期主要表现为肌肉湿重下降、肌细胞截面积减小，后期主要表现为肌纤维形态结构的破坏并予以结缔组织填充。

大量研究表明脊髓损伤后瘫痪肌肉明显萎缩，以肌纤维数目减少和残存肌纤维萎缩(shrinking)为特点，主要表现为肌肉截面积缩小、肌肉湿质量下降、肌间脂肪(Intramuscular fat，IMF)堆积。Landry等^[9]报道小鼠在脊髓横断损伤后7 d，比目鱼肌湿质量降低32%，且后肢容积下降28%。Hutchinson等^[10]在大鼠胸脊髓挫伤实验中，发现比目鱼肌和内侧腓肠肌湿质量在脊髓损伤后1周分别下降22%和25%，在脊髓损伤后3周分别下降10%和16%，在脊髓损伤后10周保持3周时水平。Castro等^[11]报道在脊髓损伤后24周，腓肠肌与比目鱼肌横截面积分别减少了24%和12%。 Gorgey等^[12]采用MRI技术，发现脊髓损伤后6周大腿肌肉横截面积较对照组缩小33%，肌间脂肪横截面积增加26%，在随后的3个月肌肉横截面积无明显缩小，但肌间脂肪横截面积较前增加了26%。然而关于肌肉形态结构的改变及其动态过程研究相对较少。有文献报道，脊髓横断性损伤后苏木精-伊红染色光镜观察发现，在脊髓损伤后10 d趾长伸肌和比目鱼肌形态上没有明显变化^[13]，表明了在脊髓横断后肌纤维没有明显的破坏，而在实验中也发现内侧腓肠肌在4周内均未见明显变化。也有研究显示，大鼠在T₆脊髓横断性损伤后^[14]，大体观察趾长伸肌呈进行性萎缩，并且肌肉干质量在脊髓损伤后10 d降至最低；光镜和免疫化学染色表明在横断后2周肌纤维萎缩，考虑肌细胞面积有所缩小，但形态结构无明显变化，这与作者的早期观察并不冲突。综上所述，实验结果表明，大鼠在完全性横断性脊髓损伤后自然病程中，损伤平面以下周围神经、运动终板、骨骼肌的形态结构均呈规律性改变^[15-18]，损伤后12周时已有显著变化，24周时呈不可逆变化。如果在本实验观察形态学的同时，纳入损伤平面以下行为学和神经电生理学的观察指标，将能更全面的反映损伤平面以下神经肌肉的运动功能变化^[19-28]。同时，实验在脊髓损伤后其自然病程中发生的形态学改变可能对人类的脊髓损伤研究有一定的启示作用，并提供一定的时间窗依据。

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